Приготовление гистологических срезов

Изучение патологических процессов на клеточном и тканевом уровне производится при помощи микроскопических исследований. Гистологический метод исследования необходим для изучения строения и функции клеток в состоянии нормы, патологии и экспериментальном периоде. Для гистологического исследования берутся элементы тканей и органов. Толщина исследуемого образца не может превышать 1 см3.

Образцы тканей могут браться у человека сразу после смерти (чем быстрее, тем лучше) – аутопсия. Также материал может браться во время операции или непосредственно в диагностических целях при помощи специальных инструментов – биопсия.

Приготовление образцов

Приготовление образцов происходит в несколько этапов:

  • Фиксация материала.
  • Приготовление среза.
  • Процесс окрашивания среза.

Суть фиксации материала заключается в остановке естественных процессов в тканях и клетках. Это необходимо для того, чтобы во время купировать процесс гниения и ферментативные изменения в структуре тканей.

В фиксируемых тканях за счет физико-химических процессов происходит свертывание (коагуляция) белков и липоидной составляющей. Это состояние позволяет тканям долго храниться в неизменном виде, без реакции на различные воздействия. Проще говоря, фиксация тканей проводится с целью сохранения прижизненной структуры биологического материала.

Для фиксации тканей применяются специальные жидкости (фиксаторы). Наиболее популярными фиксаторами можно назвать следующие варианты жидкостей:

  • Формальдегид.
  • Спирт (96, 100%).
  • Осмиевая кислота.

Выше перечислены простые фиксаторы. Также для фиксации тканей применяются более сложные варианты фиксаторов (растворы):

  • Спирт-формол.
  • Жидкость Ценкера.
  • Двухромовоокислый калий.

В списках указаны лишь некоторые виды применяемых фиксаторов. Продолжительность необходимого для фиксации образцов тканей периода может варьироваться от нескольких часов до суток. Длительность зависит от особенностей исследуемых образцов и типа выбранного фиксатора. После того как этап фиксации пройден необходимо произвести промывку материала (в течение нескольких часов) в проточной воде. Это делается для того чтобы освободить образцы от излишков фиксирующей жидкости и осадочной взвеси.

Мутные непрозрачные образцы не подходят для исследования. Такие кусочки материала не позволят получить необходимую информацию. Перед тем как приступить к одному из главных этапов – осуществлению среза, образцы промываются чистой водой в течение нескольких часов. Далее, материал подвергается процессу обезвоживания. Обезвоживание осуществляется при помощи проведения тканевого образца через спирты возрастающей крепости. Этот этап длительный. В каждом спирте кусочки материала находятся от 2-3 часов до суток.

После обезвоживания проводится заливка образцов. Этот этап необходим для уплотнения тканей и получения качественных блоков для исследования. Уплотнение проводится путем замораживания (срочная биопсия) или путем заливки парафином или целлоидином. Заливка парафином - достаточно длительная процедура (от 24 часов и дольше). Такой вариант уплотнения образцов используется для осуществления исследования в обычном режиме. Для лучшей визуализации отдельных структур тканей срезы окрашивают. Для окрашивания применяют специальные гистологические красители (кислые, основные, специальные).

Подготовленные к изучению образцы исследуют при помощи специального микроскопа.

Прежде чем приступить к изучению гистологического препарата необходимо убедиться, что последний полностью соответствует ряду обязательных требований:

  • В материале должны быть сохранены прижизненные структуры.
  • Срез должен быть тонким и прозрачным.
  • Структуры, которые требуется подвергнуть изучению должны быть четко визуализированы за счет окрашивания.
  • Препараты должны иметь длительный срок хранения.

При качественном приготовлении препарата достичь соответствия всем перечисленным требованиям достаточно просто. Однако нельзя исключить возможность возникновения небольших погрешностей. Если вовремя распознать некоторые виды неточностей, купировать брак, создать качественный материал вполне возможно.

Самыми распространенными погрешностями при приготовлении срезов можно назвать следующие варианты:

  • Крошение среза.
  • Выпадение материала из парафиновой массы.
  • Невозможность нарезки материала.
  • Разрыв материала.

Те или иные погрешности могут возникать по разным причинам. Иногда в основе нарушения качества образца лежат ошибки во время изготовления. Для устранения каждой погрешности предусмотрены определенные алгоритмы действий.

Методы гистологического исследования

Для осуществления микроскопического исследования необходимы тонкие кусочки материала. Ширина таких кусочков измеряется в микрометрах. Для удобства получения таких срезов используются специальные приборы – микротомы. Конструкция этого прибора предусматривает возможность получения срезов толщиной 5-10 микрометров.

Основным методом исследования в гистологии является микроскопия. При помощи микротома можно изготавливать тончайшие срезы, подходящие для проведения микроскопических исследований. Получение среза происходит за счет движения ножа в одном направлении. Толщина среза задается на этапе срабатывания механизма подъема.

Для изготовления срезов из материала, залитого парафином или целлоидином, используют радиальный, ротационный или санный микротом.

Для получения среза с растительных или животных тканей могут применяться специальные замораживающие микротомы. Для микроскопического исследования используется несколько методов приготовления срезов. Для каждого из методов выбираются определенные виды микротомов и применяются определенные четкие алгоритмы действий.

Гистологические срезы бывают:

  • Ступенчатые.
  • Серийные.
  • Горизонтальные.

Могут производиться срезы фиксированного и нефиксированного материала. Все зависит от характера исследуемых тканей и основных целей проведения означенного исследования. Также в гистологии существуют другие методы приготовления срезов.

Микротомы и их применение

Как уже было сказано выше, срезы в гистологии создаются при помощи специального устройства – микротома. В самом названии заложена расшифровка предназначения прибора – micros (маленький), tome (рассечение). Одним из самых используемых можно назвать санный микротом.

Название прибора произошло от принципа работы механизма, который базируется на подаче ножа с зажимом при помощи специальных салазок. Санный микротом предназначен для осуществления парафиновых срезов. Как правило, такой прибор работает с одноразовыми лезвиями или кассетами. Такой высокоточный микротом состоит из станины, механизма микроподачи, подъемного механизма, зажимов для блоков, ножедержателя.

Такой аппарат позволяет изготавливать срезы толщиной от 0,5 до 60 микрометров. Санный микротом отличается высокоточной регулировкой толщины среза. Функция подачи материала может быть механической или ручной. Данный прибор предназначен для осуществления рутинных исследований в области медицины, ботаники и биологии.

Ротационный микротом - прибор с неподвижным ножом и подвижным столиком. В приборе предусмотрена моторизованная подача образца. Этот микротом предназначен для использования в гистологической лаборатории для проведения исследований, направленных на решение гистологических и гистопатологических задач.

Для получения срезов с нефиксированных тканей или в тех случаях, когда необходимо срочное проведение исследования используются замораживающие микротомы. Такие приборы снабжены замораживающим столиком, на котором и закрепляется исследуемый образец. Главным правилом успешного получения гистологического среза при помощи микротома является правильный выбор угла наклона ножа и угла сечения. Наилучшим углом наклона является тот, при котором плоскость лезвия находится параллельно верхней части блока.

Если выбрать угол наклона больший, чем требуется, образуется риск, что срез будет крошиться. При меньшем угле наклона лезвие будет скользить по поверхности материала. Получение требуемого результата при таком положении ножа невозможно. Величина угла сечения зависит от характера исследуемого материала. Чем образец мягче, тем меньше будет угол резания. При обработке мягких блоков неплохим вариантом считается косое расположение ножа.

Резание на микротоме

Для приготовления срезов с парафинированных объектов или образцов, обработанных целлоидином, опять же чаще всего используют ротационный микротом.

Сначала блок подвергают обрезке. Это необходимо для устранения свободного парафина или другого уплотнителя. Если эту процедуру не произвести, срез может получиться неравномерным, морщинистым и, как следствие, малоинформативным. Также сморщивания можно избежать при помощи охлаждения исследуемого материала.

Далее, парафиновый блок прочно закрепляется в зажиме. Предварительно необходимо выверить правильный угол расположения ножа и выбрать необходимый угол резания. После этого нужно используя регулировку механизма подачи, установить блок так, чтобы его поверхность находилась от лезвия ножа на расстоянии 0,5-1 мм.

После осуществления подгонки проводится установка микрометрической шкалы для получения первых толстых срезов. После этого производится моделирование блока (срезка излишков парафина, предание прямоугольной формы). Заключительным этапом является выставление микрометрической шкалы на задуманную толщину и осуществление окончательной резки материала.

Loading